WPROWADZENIEBiałaczka kocia jest szeroko rozpowszechnioną i straszliwą chorobą zakaźną kotów, wywoływaną przez wirusa białaczki kociej (z ang. FeLV) (Jarret 1975). FeLV został po raz pierwszy rozpoznany w 1964 (Jarret i współ. 1964) i jest retrowirusem występującym w warunkach naturalnych, który w niektórych państwach nadal uważany jest za odpowiedzialny za większość śmiertelnych chorób u kotów domowych. Na podstawie badań klinicznych nie udało się wykazać związku pomiędzy białaczką ludzką, a wirusem FeLV (Sordillo i Markovich 1982), ale ludzkie komórki szpikowe mogą być zakażone tym wirusem in vitro (Morgan i wsp. 1993). Zakażenie wirusem FeLV może doprowadzić do trwałego lub przejściowego zakażenia (Hoover i wsp. 1975; Lutz i wsp. 1980; Hoover i Mullins 1991). Trwale zainfekowane koty umierają w większości wypadków w ciągu 4 miesięcy od zakażenia (McClelland i wsp. 1980). Przejściowo zakażone koty nabierają odporności na infekcję wirusem po pierwszej wiremii i są uznawane za odporne na reinfekcję (Charreyre i Padersen 1991), podczas gdy w innej grupie badanych kotów wykazano pojawienie się odporności po pierwszym kontakcie z wirusem FeLV oraz brak objawów klinicznych wynikających z zakażenia (Rojko i Kociba 1991). Wirus FeLV rozprzestrzenia się poziomo oraz pionowo poprzez ślinę, krew, łzy, mleko samic, a także inne płyny fizjologiczne, ażeby doszło do zakażenia potrzebny jest ścisły kontakt między zwierzętami. Istnieją również doniesienia na temat przenoszenia się wirusa poprzez łożysko (Hoover i Mullins 1991). Alternatywną drogą zakażenia stanowić mogą owady ssące, odżywiające się krwią, które mogą przenosić wirusa białaczki pomiędzy kotami, bez potrzeby bezpośredniego kontaktu między nimi. Pchły są dobrze znane jako wektory przenoszące bakterie, riketsje, a nawet tasiemce (Hinaidy 1991; Mehlhorn 2001). Niemniej jednak niewiele jest wiadomo na temat przenoszenia wirusów za pośrednictwem pcheł. W niniejszym artykule zostały opisane badania dotyczące potencjalnego wektora wirusa białaczki kociej, jakim jest pchła kocia C. Felis.
MATERIAŁY I METODYPchły były sztucznie hodowane i karmione poprzez błony w tak zwanym „sztucznym psie” z FleaData Inc. (Freeville, USA). Temperatura powietrza wewnątrz „sztucznego psa” wynosiła 39°C, wyrównano ją z temperaturą krwi, wynoszącą 37°C. RNA wirusa zostało wyizolowane z próbek krwi, poprzez zastosowanie metody QiAamp® Viral RNA Mini Kit, zgodnie z zaleceniami producenta (Qiagen, Hilden, Niemcy). Przygotowanie wirusowego RNA pobranego od pcheł polegało na zamrożeniu pcheł w ciekłym azocie i roztarciu ich następnie w metalowym moździerzu. Rozcier został następnie wymieszany z roztworem buforującym i preparat zawierający RNA wirusa został przygotowany zgodnie z zaleceniami producenta. Preparat z odchodów pcheł, zawierający wirusowe RNA, został przygotowany jedynie poprzez zmieszanie odchodów z roztworem buforującym, dalsze przygotowanie RNA było zgodne z zaleceniami producenta. Aby nie dopuścić do skażenia DNA wszystkie preparaty zostały poddane działaniu DNA-zy I pochodzącej z zestawu „DNAfree Kit” zgodnie z zaleceniami podanymi na ulotce (Ambion, Austin, USA). Odwrotna transkrypcja wirusowego RNA została dokonana na bazie jednoniciowego cDNA pochodzącego z gotowego zestawu do RT-PCR, wszystkie czynności wykonano według wskazówek producenta (Roche, Indianapolis, USA). Amplifikacji i wykrycia cDNA pochodzącego od FeLV dokonano dzięki wysoce czułemu, zlokalizowanemu PCR (ang. nested PCR), tak jak wcześniej zostało to opisane (Miyazawa i Jarret 1997). Amplifikacja DNA wykonana została w 100 ml probówkach reakcyjnych, w całkowitej objętości wynoszącej 50 ml, z zastosowaniem gotowego zestawu „Taq PCR Core Kit”, zgodnie z protokołem działań załączonym przez producenta (Qiagen, Hilden, Germany).
Ryc. 1. Przegląd schematu eksperymentu. Początkowa populacja pcheł była karmiona przez 24 godziny krwią zakażoną wirusem białaczki kociej. Pchły i odchody pchle zostały przebadane na obecność wirusowego RNA. Jedna populacja była następnie karmiona przez 24 godziny (etap 1), druga przez 5 godzin (etap 2) niezakażoną, niewiremiczną krwią. Pchły i ich odchody zostały przebadane na obecność wirusowego RNA (test na pobranie wirusa), tak jak i 2, zastosowane na tym etapie badań, próbki krwi (test na przenoszenie wirusa). Podczas trzeciego karmienia, pchły zostały znów przeniesione do świeżej i niezakażonej krwi i pobierały ją odpowiednio przez 24 godziny (etap 3) i 5 godzin (etap 4). Pchły, odchody pchle i stosowane na tym etapie badań próbki krwi zostały przebadane, tak jak miało to miejsce podczas drugiego karmienia, w celu wykrycia wirusowego RNA.
Ryc. 2. PCR amplifikacja cDNA z zastosowaniem wewnętrznego, pierwotnego kodonu startowego skierowanego na fragment o wielkości 601 bp, pomiędzy U3 i regionem gag RNA wirusa białaczki kociej. Przed zastosowaniem RT-PCR, wszystkie próbki zawierające RNA poddano działaniu DN-azy I w celu wykluczenia obecności komórkowego provirusowego DNA, który mógłby być wykryty podczas testu zamiast wirusowego RNA. 1: Odchody pchle po 24 godzinnym karmieniu krwią zakażoną wirusem białaczki kociej. 2: Pchły po karmieniu przez 24 godziny krwią zakażoną wirusem białaczki kociej. 3: Niezakażona krew po karmieniu w etapie 1. 4: Pchły po karmieniu w etapie 1. 5: Niezakażona krew po karmieniu w etapie 3. 6: Pchły po karmieniu w etapie 3. 7: Odchody pchle po karmieniu w etapie 1. 8: Odchody pchle po karmieniu w etapie 3. 9: Niezakażona krew po karmieniu w etapie 2. 10: Pchły po karmieniu w etapie 2. 11: Odchody pchle po karmieniu w etapie 2. 12: Niezakażona krew po karmieniu w etapie 2. 13: Pchły po karmieniu w etapie 4. 14: Odchody pchle po karmieniu w etapie 4. Wszystkie badania zostały wykonane również z zastosowaniem niewiremicznej krwi jako próba negatywna (wyniki nie są pokazane). Nie wykryto wirusowego RNA. M: PeqGold 100 bp drabinka (PeqLAb).
WYNIKIPodczas pierwszego karmienia, początkowa populacja pcheł składająca się ze 110 osobników została zakażona wirusem FeLV poprzez podawanie im przez 24 godziny 2 ml krwi od zakażonego kota (Ryc. 1). Aby sprawdzić czy eksperyment zakończył się sukcesem, 10 pcheł oraz wszystkie odchody od badanych osobników zostały przebadane na obecności RNA wirusa białaczki kociej. Wirusowe RNA zostało wykryte zarówno w próbkach wykonanych z osobników dorosłych pcheł, jak i z próbek zawierających pchle odchody (Ryc. 2, ścieżka 1 i 2). Wirus białaczki kociej, włączony do genomu pcheł poprzez spożycie przez nie zakażonej krwi, był wydalany wraz z odchodami. Pozostałe 100 pcheł zostało podzielonych na dwie populacje po 50 sztuk i podano im 300 ml niezakażonej krwi od zdrowego kota, pierwsza populacja była karmiona przez 24 godziny (ryc. 1, etap 1), a populacja druga przez 5 godzin (ryc. 1, etap 2). Po określonym czasie 10 pcheł i odchody pochodzące z obu populacji zostały przebadane na obecność wirusa kociej białaczki. Wirusowe RNA wykryto zarówno u pcheł jak i w odchodach pchlich w obu populacjach (Ryc. 2, ścieżka 4,7,10 i 11). RNA wirusa białaczki kociej było wykrywalne odpowiednio 5 i 24 godziny po pobraniu przez pchły niezakażonej krwi. Aby wykryć czy doszło do transmisji wirusa, przebadano krew pozostałą po 1 i 2 transfekcji. Wirusowe RNA było wykrywalne w obu próbkach pochodzących od wcześniej niezakażonej krwi, pobranej od kotów zdrowych z klinicznego punktu widzenia (Ryc. 2, ścieżka 3 i 9). Wskazuje to na to, iż w badaniach in vitro pchła kocia C. Felis może być wektorem dla RNA wirusa kociej białaczki. Wirusowe RNA było wykrywalne u pcheł i w pchlich odchodach do 24 godzin. Dodatkowo pchły efektywnie przenosiły RNA, pochodzące od wirusa białaczki kociej, bezpośrednio z próbek krwi zakażonej do niezakażonej. W badaniach prowadzonych podczas trzeciego karmienia pcheł, te same osobniki były ponownie karmione świeżą, niezakażoną krwią (Ryc. 1, etap 3 i 5). Odpowiednio po 5 i 24 godzinach, pchły, ich odchody oraz próbki krwi przebadano na obecność wirusa białaczki kociej. Po trzecim karmieniu nie udało się wykryć wirusowego RNA, ani u pcheł, ani w ich odchodach, ani w próbkach krwi (Ryc.2,ścieżka 5,6,12 i 8,13,14). Wirusowe RNA było wykrywalne u pcheł do 24 godzin po karmieniu. W tym czasie pchły również wydalały wirusowe RNA wraz z odchodami. Dodatkowo, pchły były w stanie przenieść RNA wirusa białaczki kociej bezpośrednio z jednej próbki krwi do drugiej, tym samym funkcjonując jako wektor dla wirusa.
DYSKUSJAWiadomym jest iż, wirus białaczki kociej przenosi się w populacji kociej poprzez ślinę (podczas lizania), krew (zadrapania i walki) i wszystkie pozostałe płyny fizjologiczne (Hardy i wsp. 1975). Bardzo bliski kontakt między zakażonym i zdrowym osobnikiem jest wystarczający, aby wirus mógł rozprzestrzenić się w populacji lub wśród kotów żyjących w jednym gospodarstwie domowym (Essex i wsp. 1977). Wyniki naszych badań wskazują na to, iż może istnieć inny, niezależny od bliskiego kontaktu kotów, sposób przenoszenia wirusa białaczki kociej poprzez kocią pchłę C. Felis. Pchły są ważnym wektorem dla wielu patogenów takich jak bakterie i riketsje. Z uwagi na szeroki zakres żywicieli jakie posiada pchła, patogeny mogą być przenoszone nawet pomiędzy poszczególnymi gatunkami, na przykład ze szczurów na człowieka (dżuma). Ostatnio dyskutowano nawet nad zakażeniem ludzi Rickettsia felis przenoszonymi przez pchły (Richter i wsp. 2002). Niemniej jednak, niewiele jest wiadomo na temat pcheł będących wektorami dla wirusów. Istnieją doniesienia wskazujące na to, iż niektóre wirusy mogą przebywać nienaruszone w pchłach przez co najmniej 24 godziny (Smetana 1965). Możliwość przenoszenie poprzez pchły wirusa białaczki kociej, jak też powiązanego z HIV wirusa niedoboru immunologicznego kotów, nie jest znana. Nasze badania wykazały, iż pchły karmione przez 24 godziny krwią pochodzącą od kotów zakażonych wirusem białaczki kociej wydalają wraz z odchodami wirusowe RNA. Mając na uwadze liczne możliwości przenoszenia wirusa białaczki kociej, wynik naszych badań może nabrać znaczenia. Istnieje ryzyko, że zdrowy kot wetrze odchody pchle w skórę w wyniku wygryzania miejsca po ukąszeniu pchły, bądź też podczas walki z innym kotem.
Kolejnym wynikiem naszych badań może być wykazanie bezpośredniej transmisji wirusa białaczki kociej poprzez pchłę i w wyniku jej ukąszenia. Wirus białaczki kociej może zostać wchłonięty przez pchłę, a następnie wydalony wraz z jej odchodami lub też bezpośrednio przeniesiony w trakcie pobierania przez nią krwi. Nie wiadomo jednak czy ten sposób przenoszenia wirusa w warunkach in vivo ma znaczenie i czy może powodować jakiekolwiek skutki kliniczne, zagadnienie to wymaga więc dalszych badań. Z racji tej, iż znane jest ryzyko przenoszenia patogenów za pomocą pchlich ukąszeń zarówno na ludzi, jak i na zwierzęta, należy wnioskować, że zaleca się zapobieganie infestacjom pchlim u zwierząt domowych. Regularne stosowanie skutecznych insektycydów w formulacji spot on, takich jak imidakloprid, z racji jego potwierdzonych właściwości terapeutycznych i prewencyjnych, zapobiega pchlim infestacjom i tym samym przenoszeniu chorób.
Tłumaczenie artykułu: „ The Feline Leukemia Virus (FeLV) and the Cat Flea (Ctenocephalides felis).”
VOBIS M., D’HAESE J., MEHLHORN H. & MENCKE N.
Institute for Zoomorphology, Cell Biology and Parasitology, Heinrich-Heine University, D-40225 Düsseldorf, Germany;
Bayer AG, BHC-Business Group Animal Health, D-51368 Leverkusen, Germany
Poinformuj kolege
|
Wersja do druku
|
Send this article
|
